absorbansiasam sulfatbiovine serum albuminBSAfolinkurva standarnatrium hidroksidanatrium karbonatpanjang gelombangpHproteinregresispektrofotometertembaga sulfat
PART. 2 BIOKIMIA PASCA PANEN - PENGENALAN SPEKTROFOTOMETER
A. Spektrofotometer
Spektrofotometer
merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan
cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari
cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari
cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet
(Cairns, 2009).
Spektofotometer
banyak digunakan dalam penentuan konsentrasi suatu larutan. Secara umum
spektrofotometer dibedakan menjadi empat macam, yaitu spektrofotometer
ultraviolet, spektrofotometer sinar tampak, spektrofotometer infra merah dan
spektrofotometer serapan atom. Spektrofotometer bekerja dengan cara mengukur
banyaknya cahaya yang melewati suatu sampel yang akan diserap atau diteruskan
(Keenan, 1992).
Spektrofotometri
merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk
menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif maupun kualitatif
yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Cahaya dimaksud dapat berupa cahaya
visible, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom atau molekul
namun yang lebih berperan adalah electron valensi. Sinar atau cahaya yang
berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai radiasi elektromagnetik
(Kautsar, 2010).
B. Panjang
Gelombang
Menurut Hikmah (2012), panjang gelombang yang biasa digunakan dalam
spektrofotometer yaitu sebagia berikut :
Panjang
Gelombang
·
400 – 435 nm = Violet - Hijau - Kuning
·
435 – 480 nm = Biru - Kuning
·
480 – 490 nm = Biru Hijau - Orange
·
490 – 500 nm = Hijau biru - Merah
·
500 – 560 nm = Hijau - Ungu
·
560 – 580 nm = Hijau – Kuning
–Violet
·
580 - 595 nm = Kuning - Biru
·
595 - 650 nm = Orange – Biru - Hijau
·
650 – 760 nm = Merah – Hijau -
Biru
A. Prinsip
Kerja Spektrofotometer
Prinsip kerja spektrofotomater berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian
cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi
dipancarkan (It). Transmitan adalah perbandingan
intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan
intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati sampel (Io) (Seran, 2011).
Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan Bahar (2007),
sebagai berikut:
Sumber cahaya >>Monokromator>>Contoh sampel>>Detektor>>Piranti pembaca
A. Kurva
Standar
Metode pengujian kualitatif dan
kuantitatif menggunakan spektrofotometer adalah penentuan jumlah komponen bahan
dengan mengukur nilai absorbansinya, dalam mengukur nilai absorbansi digunakan larutan standar yang memiliki konsentrasi tertentu yang digunakan sebagai acuan (standar) sehingga didapatkan nilai absorbansinya yang akan dikonfersi menggunakan regresi linier sehingga data
absorbansi larutan standar tersebut dapat dirangkai dalam suatu kurva yang disebut kurva standar. Kurva standar digunakan untuk menentukan
konsentrasi sampel yang akan dianalisa jumlah komponennya yang terkandung didalam sampel. Kurva standar membandingkan antara konsentrasi sampel yang dilambangkan sebagai sumbu x sedangkan nilai
absorbansi dilambangkan dengan sumbu y, kemudian dari data nilai absorbansi
sampel yang telah diketahui ditarik garis horizontal ke arah garis linier sehingga terbentuk titik potongan
antara absorbansi sampel dengan garis linier yang dianggap sebagai konsentrasi
sampel yang /
dianalisis (Bahar, 2007).
dianalisis (Bahar, 2007).
B. Bovine Serum Albumin (BSA)
Bovine
Serum Albumin (BSA)
adalah protein referensi yang diterima secara universal untuk kuantisasi protein total. Standar albumin justru dirumuskan di 2mg/mL dalam natrium klorida 0,9% ultra murni (saline)
solusi. Produk ini tersedia dalam tiga format paket yang nyaman: ampul kaca
1mL, 50 ml botol polypropylene, dan set lengkap berisi tujuh siap digunakan
pengenceran (Anonim, 2013a).
Larutan Bovine
Serum Albumin (BSA) merupakan larutan standar yang
digunakan untuk menentukan kadar protein dengan metode Bradford
(Keenan 1992). Tingkat
ketelitian metode Bradford dalam menentukan kadar protein cukup tinggi karena
koefisien penghentian dari kompleks albumin larutan standar BSA adalah konstan
selama rentang konsentrasi
flip-1 ( Stoscheck 1990).
flip-1 ( Stoscheck 1990).
C. Persamaan Regresi
Fungsi regresi adalah fungsi yang diperoleh ketika mencari
sebuah persamaan garis yang mendekati titik-titik yang berikan dan titik-titik tersebut biasanya tidak membentuk persamaan garis linear
seperti biasanya. Salah satu contohnya yakni, titik
biasanya memiliki kordinat X dan Y. Jika memiliki beberapa titik di (2,5), (4,9),
(3,7), (7,15), dan (5,11). Persamaan garis dari titik-titik tersebut adalah Y=2X+1 yang
menyatakan bahwa fungsi garis Y=2X+1 akan melewati semua titik-titik tersebut
di atas dan membentuk sebuah garis lurus linear. Jika
titik-titik yang diberikan tidak teratur artinya, titik tersebut jika
ditarik semua titik-titiknya tidak akan membentuk sebuah garis linear yang
tepat melalui titik titik tersebut. Contoh titiknya seperti ini, (1,1), (2,2),
(3,4), (5,6) dan (7,9). Jika ingin menentukan persamaan garisnya, maka bisa
menggunakan fungsi regresi untuk memperoleh hasilnya. Persamaan
fungsi regresi, biasanya disederhanakan persamaannya manjadi Y=bX+a
(Marga, 2009).
Rumus untuk mencari mencari nilai dari b menurut Marga (2009) yaitu:
Keterangan:
n = banyak data yang dimasukkan
∑(xi.yi) = jumlah semua bilangan hasil perkalian Xi dan Yi.
∑Xi.∑Yi = jumlah semua X dikalikan dengan jumlah semua Y.
∑(Xi2) = jumlah semua nilai X yang dikuadratkan
(∑Xi)2 = kuadrat dari semua jumlah X
∑(xi.yi) = jumlah semua bilangan hasil perkalian Xi dan Yi.
∑Xi.∑Yi = jumlah semua X dikalikan dengan jumlah semua Y.
∑(Xi2) = jumlah semua nilai X yang dikuadratkan
(∑Xi)2 = kuadrat dari semua jumlah X
Regresi merupakan suatu
alat ukur yang juga dapat digunakan untuk mengukur ada atau tidaknya korelasi antarvariabel. Analisis
regresi mempelajari hubungan yang diperoleh dinyatakan dalam persamaan matematika yang menyatakan hubungan fungsional antara variabel-variabel. Hubungan fungsional antara satu variabel prediktor dengan satu variabel kriterium disebut analisis regresi sederhana (tunggal), sedangkan hubungan fungsional yang lebih dari satu variabel disebut analisis regresi ganda. Analisis
regresi lebih akurat dalam melakukan analisis korelasi, karena pada
analisis itu kesulitan dalam
menunjukkan slop (tingkat perubahan suatu variabel terhadap variabel
lainnya dapat ditentukan). Dengan demikian maka melalui analisis regresi,
peramalan nilai variabel terikat pada nilai variabel bebas lebih akurat
pula (Amirullah, 2012).
D. Natrium
Hidroksida
(NaOH)
Natrium hidroksida (NaOH), juga
dikenal sebagai soda kaustik atau sodium hidroksida, adalah sejenis basa logam
kaustik. Natrium Hidroksida terbentuk dari oksida basa Natrium Oksida
dilarutkan dalam air. Natrium hidroksida membentuk larutan alkalin yang kuat
ketika dilarutkan ke dalam air. NaOH digunakan di berbagai macam bidang industri,
kebanyakan digunakan sebagai basa dalam proses produksi bubur kayu dan kertas,
tekstil, air minum, sabun dan deterjen. Natrium hidroksida murni berbentuk
putih padat dan tersedia dalam bentuk pelet, serpihan, butiran ataupun larutan
jenuh 50%. Bersifat lembap cair dan secara spontan menyerap karbon dioksida
dari udara bebas. Sangat larut
dalam air dan akan melepaskan panas ketika dilarutkan dan juga larut dalam
etanol dan metanol, walaupun kelarutan NaOH dalam kedua cairan ini lebih kecil
daripada kelarutan KOH. NaOH tidaklarut dalam dietil eter
dan pelarut non-polar
lainnya (Anonim, 2012).
lainnya (Anonim, 2012).
E.
Natrium Karbonat (Na2CO3)
Natrium karbonat (juga dikenal sebagai
washing soda atau soda abu),(Na2CO3) adalah garam natrium
dari asam karbonat. Paling umum sebagai heptahidrat kristal, yang mudah
effloresces untuk membentuk bubuk putih, monohidrat tersebut.Natrium karbonat
di dalam negeri, terkenal untuk penggunaan sehari-hari sebagai pelunak air. Hal
ini dapat diekstraksi dari abu macam-macam tanaman. Hal ini secara sintetis
diproduksi dalam jumlah besar dari garam dan kapur dalam proses yang dikenal
sebagai proses solvay (Albi, 2012).
F.
Tembaga Sulfat (CuSO4)
Tembaga(II)
sulfat, juga dikenal dengan cupri sulfat, adalah sebuah senyawa kimia dengan
rumus molekul CuSO4. Senyawa garam ini eksis di bumi dengan
kederajatan hidrasi yang berbeda-beda. Bentuk anhidratnya berbentuk bubuk hijau
pucat atau abu-abu putih sedangkan bentuk pentahidratnya (CuSO4.5H2O),
berwarna biru
terang (Anonim, 2013b).
terang (Anonim, 2013b).
Penetapan kadar protein dalam serum
dengan metode Biuret adalah pengukuran serapan cahaya kompleks berwarna ungu
dari protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret dimana, yang membentuk
kompleks adalah protein dengan ion
Cu2+ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam suasana basa. Semakin
tinggi intensitas cahaya yang diserap oleh alat maka semakin tinggi
pula kandungan protein yang terdapat di dalam serum tersebut. Penetapan kadar
albumin dapat dilakukan dengan dengan metode biuret dengan menggunakan
spektrofotometer. Prinsip metode ini adalah pengukuran serapan cahaya kompleks
berwarna ungu dari protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret dimana, yang
membentuk kompleks adalah protein dengan ion Cu2+ yang terdapat dalam pereaksi
biuret dalam suasana basa. Semakin tinggi absorbansi yang diberikan, semakin
tinggi pula kandungan albumin yang terdapat di dalam serum tersebut. Pereaksi biuret mengandung tiga macam reagen yaitu reagen yang pertama adalah CuSO4
dalam aquadest dimana reagen ini berfungsi sebagai penyedia ion Cu2+ yang
nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. Reagen yang kedua adalah
K-Na-Tartrat yang berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+
sehingga tidak mengendap. Reagen yang ketiga adalah NaOH dimana fungsinya
adalah membuat suasana basa. Suasana basa akan membantu pembentukan Cu(OH)2
yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-. Pada tabung dimasukkan Natrium sulfit
25% sebanyak 2 mL ini kemudian dimasukkan sampel plasma 0,2 mL dan 2 mL kemudian
dikocok kuat. Penambahan natrium sulfit dan eter ini adalah berguna untuk
memisahkan antara albumin dengan protein plasma lainnya seperti globulin,
fibrinogen dan lain-lain. Selanjutnya didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan
cairan, lapisan atas terdiri dari eter dan protein plasma lainnya. Sedangkan
bagian bawah mengandung albumin sehingga lapisan bagian atas dibuang dan
lapisan bagian bawah kemudian ditambahkan dengan pereaksi biuret dan dikocok
(Thed, 2012).
G.
Asam Sulfat (H2SO4)
Asam sulfat mempunyai rumus kimia H2SO4,
merupakan asam mineral (anorganik) yang kuat. Zat ini larut dalam air pada
semua perbandingan. Asam sulfat mempunyai banyak kegunaan, termasuk dalam
kebanyakan reaksi kimia. Kegunaan utama termasuk pemrosesan bijih mineral,
sintesis kimia, pemrosesan air limbah dan pengilangan minyak. Disebabkan asam sulfat bersifat mengeringkan, asam sulfat merupakan agen pengering yang
baik, dan digunakan dalam pengolahan kebanyakan buah-buahan kering. Reaksi
hidrasi (pelarutan dalam air) dari asam sulfat adalah reaksi eksoterm yang
kuat. Jika air ditambah kepada asam sulfat pekat, terjadi pendidihan.
Senantiasa tambah asam kepada air dan bukan sebaliknya. Sebagian dari masalah
ini disebabkan perbedaan isi padu
kedua cairan. Air kurang padu dibanding
asam sulfat dan cenderung untuk terapung di atas
asam (Dunan, 2008).
asam (Dunan, 2008).
Reaksi tersebut menurut Dunan (2008),
membentuk ion hidronium:
H2SO4 + H2O → H3O++
HSO4-.
H. Reagen
Folin
Prinsip metode
Folin-Ciocalteu adalah oksidasi gugus fenolik hidroksil. Pereaksi ini
mengoksidasi fenolat (garam alkali), mereduksi asam heteropoli menjadi suatu
kompleks molibdenum-tungsten (Mo-W). Fenolat hanya terdapat pada larutan basa,
tetapi pereaksi Folin-Ciocalteu dan produknya tidak stabil pada kondisi basa.
Selama reaksi belangsung, gugus fenolik-hidroksil bereaksi dengan pereaksi
Folin-Ciocalteu, membentuk kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru
dengan struktur yang belum diketahui dan dapat dideteksi dengan
spektrofotometer. Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat setara dengan
konsentrasi ion fenolat yang terbentuk, artinya semakin besar konsentrasi
senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang akan mereduksi asam
heteropoli sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat (Singleton dan
Rossi, 1965).
I. Aquadest
Aquadest
digunakan sebagai pelarut. Karena aquadest mengandung airmurni. Hal ini
menyebabkan aquadest lebih mudah larut (Filronset, 2012). Aquadest hanya
berfungsi sebagai pelarut. Aquadest bukanlah reagen, dan aquadest memiliki pH
netral, tidak asam serta tidak basa (Putri, 2012).
DAFTAR PUSTAKA
Anonim.
2012. Natrium Hidroksida. http://id.wikipedia.org/wiki/Natrium_hidroksida. Diakses tanggal 21 februari 2013.
Makassar.
Anonim,
2013a. BSA (Biovin Serum Albumin). http://www.piercenet.com/browse.
cfm?fldID=02020108. Diakses pada tanggal 19 Februari 2013, Makassar.
cfm?fldID=02020108. Diakses pada tanggal 19 Februari 2013, Makassar.
Anonim.
2013b. Tembaga (II) Sulfat. http://id.wikipedia.org/wiki/Tembaga%28II%29_sulfat. Diakses tanggal 20 Februari 2013. Makassar.
Albi,
Muhammad Putra. 2012. Air Abu (Natrium
Karbonat). http://muhammadputraalbi.blogspot.com/2012/02/air-abu-natrium-karbonat-natrium.html. Diakses tanggal 21 februari 2013.
Makassar.
Amirullah, Muhammad. 2012. Regresi Linier /
Sedrhana,Persamaan Kuadrat sebagai regresi, Polinomial sebagai regresi ,Fungsi
Eksponen sebagai regresi. http://blog.ub.ac.id/milanamir/2012/04/26/regresi-linier-sedrhanapersamaan-kuadrat-sebagai-regresipolinomial-sebagai-regresi-fungsi-eksponen-sebagai-regresi/. Diakses
pada tanggal 20 Februari 2013.
Bahar, 2007.
Kurva Standar Dalam Praktikum Absorpsi Fisika.
Sekolah Menengah Analisa Kimia, Makassar.
Cairns
D. 2009. Intisari Kimia Farmasi Edisi Kedua. Penerjemah : Puspita Rini.
Dunan.
2008. Asam Sulfat (H2SO4).
http://chemistryanalist.wordpress.com/2008/10/25/asam-sulfat-h2so4/.
Diakses tanggal 20 Februari 2013. Makassar.
Filronset,
Marcellinus. 2012. Tinjauan Pustaka
Media Kultur. http://www.scribd.com/doc/105696807/2-2. Diakses pada tanggal 11 November 2012. Makassar.
Hikmah,
2012. Panjang Gelombang. http://hikmaharifblog.blogspot.com/. Diakses pada tanggal 20 November
2012. Makassar.
Kautsar,
Akhmad. 2010. Spektrofotometri dan
Spektrofotometer UV-Vis. http://www.scribd.com/doc/25536927/spektrofotometri-spektrofotometer-UV-Vis.
Di akses pada tanggal 19 Februari 2013, Makassar.
Di akses pada tanggal 19 Februari 2013, Makassar.
Keenan,W.
Charles. 1992. Kimia Untuk
Universitas Jilid 1. Erlangga. Jakarta.
Marga, Duken. 2009. Fungsi Regresi Linear. http://duken.info/blog/2009/09/fungsi-regresi-linear/. Diakses pada tanggal 20 Februari 2013.
Putri,
Beta Alfisyahri. 2012. Karbohidrat http://www.scribd.com/doc/88817827/KARBOHIDRAT. Dia akses pada tanggal 28 Oktober
2012. Makassar. Diakses pada tanggal 29 Oktober 2012. Makassar.
Seran, Emel. 2011. Spektrofotometer.
http://wanibesak.wordpress.com/2011/07/04/
pengertian-dasar-spektrofotometer-vis-uv-uv-vis/. Diakses pada tanggal 19 November 2013. Makassar.
pengertian-dasar-spektrofotometer-vis-uv-uv-vis/. Diakses pada tanggal 19 November 2013. Makassar.
Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total
Phenolic with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic,
16, 147.
Stoscheck,
CM. 1990. Increased uniformity in the
response of the Coomassie blue.
Thed. 2012. Uji Kadar Protein Serum Metode Biuret. http://smart-fresh.blogspot.com/2012/06/uji-kadar-total-protein-serum-metode.html. Diakses pada tanggal 22 Februari
2012
0 komentar